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百迪成軟骨誘導(dǎo)分化+染色試劑盒Kit

品名：百迪成軟骨誘導(dǎo)分化+染色試劑盒Kit: 型號： S1022-KIT

產(chǎn)品詳情
規(guī)格參數(shù)

產(chǎn)品信息

適用范圍	試劑
使用方法	1. 軟骨分化培養(yǎng)基預(yù)混液配制：室溫融化添加物 B 和添加物 C，融化后加入 A 液，充分混勻，配制成軟骨分化培養(yǎng)基預(yù)混液（2-8℃保存）。 2. 誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基配制：取 10ml 預(yù)混液置于 15ml 離心管中，加入一支添加物 D，充分混勻制成誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，此液現(xiàn)配現(xiàn)用。1ml 預(yù)混液需加入添加物 D 的量為 10μl。 ? 誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，2-8℃放置不得超過 72 小時。 3. 準(zhǔn)備所需誘導(dǎo)分化的MSC，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)85%左右時，用消化液消化細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用成軟骨誘導(dǎo)預(yù)混液重懸。 4. 220g離心5分鐘，沉淀以預(yù)混液重懸，細(xì)胞密度約2×106cells/ml，再次離心，棄上清。 5. 沉淀以成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106cells/ml。 6. 分別取500μl細(xì)胞懸液接種于15 ml離心管中，220g離心5分鐘。 ? 每管細(xì)胞的總數(shù)在5×105至1×106之間，一般以1個T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種一個軟骨球為佳，細(xì)胞數(shù)過少形成的軟骨團塊較小，細(xì)胞數(shù)過多則可能會分開成塊。正常情況下可形成1-2 mm3的團塊。離心以細(xì)胞聚團為準(zhǔn)，可適當(dāng)調(diào)整。 7. 旋松離心管蓋，將離心管輕輕豎直置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。 ? 24小時內(nèi)避免搖動細(xì)胞沉淀，以確保形成個團塊。離心管需使用聚丙烯材質(zhì)無菌管。 8. 誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，輕輕撥動離心管底，使細(xì)胞沉淀團塊懸浮，重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)養(yǎng)。 ? 細(xì)胞團塊重新懸浮的時間因細(xì)胞而定，基本在24-48小時之間，以細(xì)胞團周圍有聚攏現(xiàn)象時為準(zhǔn)。若細(xì)胞團塊貼壁較牢固，可用移液器輕輕吹動使其懸浮，注意不要吹散團塊。 9. 每2天更換新鮮完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基。換液時輕輕吸去舊培養(yǎng)基，每管加新鮮配制的成軟骨分化完全培養(yǎng)基500μl。 ? 換液時動作輕柔，以免吸出細(xì)胞團塊；誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基必須經(jīng)過復(fù)溫，否則影響誘導(dǎo) 效果。在誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后會出現(xiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)，富含軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原。 10. 誘導(dǎo)培養(yǎng)14-20天，棄去培養(yǎng)上清，DPBS洗細(xì)胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2ml/管室溫固定細(xì)胞1小時。 ? 培養(yǎng)結(jié)束時或中途可以選擇其他檢測方法，如基因表達(dá)檢測等，采用自己擬定的檢測方法則后續(xù)方案需要自行確定。 11. 棄去固定液，DPBS洗2次，脫水、石蠟包埋后切片（過程中一定注意團塊不要丟失）。 12. 阿利新藍(lán)染色：將切片進行脫臘和復(fù)水，阿利新藍(lán)染液染色30分鐘，流水沖洗5分鐘，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。 13. 結(jié)果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見藍(lán)色著色，該藍(lán)色染色的為酸性粘多糖，說明實驗所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無成軟骨能力。 ? 該鑒定方法和判定標(biāo)準(zhǔn)為定性實驗標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)具體情況設(shè)置其他判定方法和標(biāo)準(zhǔn)。 ? 以上提供的是包埋切片染色的方案，若實驗室條件限制，可選擇直接對團塊進行染色，方法見11、12、13。若試劑盒用于組織工程軟骨誘導(dǎo)，可作為除支架材料以外的誘導(dǎo)液用。 11. 棄去固定液，DPBS洗團塊2次。 12. 阿利新藍(lán)染色：向團塊中加500μl阿利新藍(lán)染液染色30分鐘。棄染色液，加純水 5ml搖動清洗5分鐘/次，反復(fù)洗5次。操作過程中避免樣本丟失，樣本始終需要保持在液體中，避免失水導(dǎo)致形態(tài)改變。 13*. 結(jié)果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見深藍(lán)色著色，肉眼觀察也可見藍(lán) 色著色，該藍(lán)色染色的為酸性粘多糖，說明實驗所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無成軟骨能力。
注意事項	1. 本產(chǎn)品所有組分均須避免反復(fù)凍融，各組分在所需要的溫度下有效期為 1 年，配制完成的預(yù)混液于 2-8℃保存，有效期 1 個月，完全培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，2-8℃保存不超過 72 小時。 2. 染色和制片過程中避免干片或失水，干片或缺水后會導(dǎo)致組織形態(tài)發(fā)生變化，影響觀察、拍照效果。根據(jù)需要可以選擇細(xì)胞核復(fù)染，不建議蘇木素復(fù)染，可以使用核固紅復(fù)染。 3. 染色過程中，染色液中的團塊不易看清，務(wù)必小心吸去上清，避免樣本丟失。樣本始終需要保持在液體中，避免失水導(dǎo)致形態(tài)改變。 4. 染色時間請根據(jù)實際情況確定，時間控制在10-30分鐘，時間太久顏色過深，可能不易分辨。 5. 使用直接進行誘導(dǎo)球染色時誘導(dǎo)周期可以適當(dāng)縮短，一般情況下15天即可有藍(lán)色著色，時間越久藍(lán)色著色相對越深。具體誘導(dǎo)周期根據(jù)實驗室的具體情況進行調(diào)整。 6. 結(jié)果拍照最好使用反射光拍照設(shè)備，用透射光的顯微鏡會導(dǎo)致結(jié)果呈深藍(lán)色或黑色。 7. 如果試劑外包裝管出現(xiàn)裂縫，應(yīng)立即停止使用。 8. 操作過程應(yīng)在無菌環(huán)境下進行，必須保證操作過程中使用的所有容器及所有直接接觸細(xì) 胞液的器具嚴(yán)格無菌。
聲明	僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。
保存條件

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間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有多向分化的潛能，在一定條件下可以體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，是 MSC 鑒定的必檢項目，在多種組織來源和制作方法的 MSC 藥品質(zhì)量控制中，成骨、成脂、成軟骨也是必檢指標(biāo)。BDBIO 人間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)試劑盒可用于鑒定人 MSC 是否具有成骨分化能力，滿足 MSC 質(zhì)量控制的要求，此外在再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基也可作為除支架以外的培養(yǎng)體系。誘導(dǎo)培養(yǎng)基還可用于研究誘導(dǎo)分化過程中的其他檢測，如 mRNA 檢測、lncRNA 檢測、microRNA 檢測、蛋白表達(dá)檢測、鈣沉積量檢測、免疫組化檢測等。

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